GB 4789.2-2016
食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定
液體樣品可直接取原液進(jìn)行檢驗(yàn)；固體或者半固體則必須依據(jù)檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，選取2-3個(gè)適宜稀釋度進(jìn)行檢驗(yàn)（一般樣品選取1:10,1:100,1:1000三個(gè)稀釋度進(jìn)行檢驗(yàn)。若遇到不常做的樣品，可適當(dāng)延長稀釋度至1：10000甚至更大）。
分別吸取1mL滅菌生理鹽水到平皿中做空白對(duì)照，若空白有菌落生長則該實(shí)驗(yàn)無效。
根據(jù)對(duì)樣品污染情況的估計(jì)，若樣品有表面蔓延生長的可能性，則待第一次傾注的瓊脂凝固后，可在表面再覆蓋一層瓊脂以避免菌落蔓延而難以計(jì)數(shù)。
本標(biāo)準(zhǔn)的難點(diǎn)在于菌落計(jì)數(shù)及計(jì)算。
1）菌落計(jì)數(shù)時(shí)，從低稀釋度的平板開始計(jì)數(shù)。若所有平板上的菌落數(shù)均小于30CFU，則需計(jì)數(shù)所有平板上的菌落數(shù)，但僅采用最接近30CFU的兩個(gè)平板的菌落數(shù)來計(jì)算最終菌落數(shù)。
以固體樣品為例，菌落數(shù)選取、計(jì)算過程及結(jié)果修約如下：
2）當(dāng)?shù)谝幌♂屘荻纫粋€(gè)板上菌落數(shù)高于30，另一個(gè)低于30，則依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)當(dāng)以介于30-300之間的菌落數(shù)作為該稀釋梯度的菌落數(shù)。
以固體樣品為例，菌落數(shù)選取、計(jì)算過程及結(jié)果修約如下：
3）若所有平板上的菌落數(shù)均大于30CFU，則只計(jì)數(shù)30-300CFU之間的平板上的菌落數(shù)，并采用這些數(shù)據(jù)，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)中給出的公式，進(jìn)行最終菌落總數(shù)的計(jì)算，此時(shí)將大于300CFU的記為“多不可計(jì)”，以TNTC表示。
以固體樣品為例，菌落數(shù)選取、計(jì)算過程及結(jié)果修約如下：
4）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)都大于300，則不能所有都記為TNTC，必須將最高稀釋度的兩個(gè)平板上的菌落數(shù)逐一的計(jì)數(shù)，再計(jì)算平均數(shù)，該平均數(shù)為該梯度的菌落總數(shù)，其余平板上的菌落數(shù)可記為TNTC。
以固體樣品為例，菌落數(shù)選取、計(jì)算過程及結(jié)果修約如下：
5）若所有平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)。
注意：最低稀釋度的選擇對(duì)結(jié)果存在較大的影響。如：某樣品經(jīng)多次檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)菌落總數(shù)較高，檢驗(yàn)人員在梯度稀釋后取1：1000，1:10000，1:100000三個(gè)梯度的稀釋液傾注平板，最終所有平板上均無菌落生長，則計(jì)算結(jié)果為＜1000CFU/mL。若選取1：10，1:100，1:1000三個(gè)梯度的稀釋液傾注平板，均無菌生長，則最終結(jié)果為＜10CFU/mL。
6）最低稀釋度兩個(gè)平板只有一個(gè)平板上長了1個(gè)菌落，若為固體樣品且本次檢驗(yàn)的最低稀釋倍數(shù)為1:10，此時(shí)計(jì)算過稱為(1+0)/2×10＝5，由于默認(rèn)固體樣品的最小檢出量為10CFU，固本次檢驗(yàn)的菌落總數(shù)結(jié)果為10CFU。
注意：對(duì)于該情況，一直存在爭議，不同的檢驗(yàn)人員可能做法不一，有人保留為5CFU，有人保留為10CFU，并無固定做法，建議實(shí)驗(yàn)室保持一貫做法，不要隨意更改。
GB 4789.15-2016
食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)
1）孟加拉紅培養(yǎng)基滅菌條件比較特殊：121℃，20min；
2）稀釋液可選擇生理鹽水、硝酸鹽緩沖液，還可以選擇無菌水；
3）正置平板培養(yǎng)。未避免孢子擴(kuò)散、菌落蔓延，可選擇使用一次性塑料培養(yǎng)皿；
4）“觀察并記錄培養(yǎng)至第5d的結(jié)果”，意味著需要從培養(yǎng)的第二天開始逐日觀察并記錄霉菌和（或）酵母的生長情況，且原始記錄須體現(xiàn)“逐日觀察”；
5）特別注意："菌落數(shù)在10以內(nèi)時(shí)，采用一位有效數(shù)字報(bào)告，菌落數(shù)在10-100之間時(shí)，采用兩位有效數(shù)字報(bào)告"，即：在直接吸取原液檢驗(yàn)時(shí)，若兩個(gè)平板上的平均菌落數(shù)小于10，則四舍五入后的數(shù)值直接記為最終結(jié)果（不可四舍五入為10），若1:10的兩個(gè)平板上一個(gè)長1個(gè)菌落，另一個(gè)無菌落生長，則平均數(shù)為0.5，最終計(jì)算結(jié)果為5，而不是10。
為防止孢子蔓延污染霉菌培養(yǎng)箱，可每周用75%酒精擦拭消毒兩次或每次檢出霉菌時(shí)用殺孢子劑消毒。
GB 4789.3-2016
食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)
不需要。配制培養(yǎng)基所用到的錐形瓶、玻璃棒、勺子等均不需要滅菌。但必須清洗干凈，表面無污漬、無殘留。煮沸完成后，取下錐形瓶，用一般常用的軟紙覆蓋瓶口，并橡皮筋纏繞，待冷卻至適宜溫度后，即可傾注培養(yǎng)基。在傾注培養(yǎng)基時(shí)，須點(diǎn)燃酒精燈，稍微灼燒錐形瓶口。
可以用電磁爐或者電熱板進(jìn)行加熱煮沸，在該培養(yǎng)基即將煮沸時(shí)調(diào)低溫度。實(shí)際操作時(shí)，不需要嚴(yán)格按照此要求進(jìn)行，加熱煮沸數(shù)秒即可。因?yàn)楸九囵B(yǎng)基很難保持煮沸2min，一旦煮沸，則培養(yǎng)基很快上涌、翻騰，若不調(diào)低問題或及時(shí)采取其它措施，則培養(yǎng)基很有可能在數(shù)秒內(nèi)噴涌出來，嚴(yán)重者可噴涌2米以上、電磁爐周圍1-2米范圍內(nèi)都是培養(yǎng)基飛濺的范圍。
3）若培養(yǎng)基未用完，是否可以冷藏起來下次用？
不可以。4789.28中已規(guī)定，固體培養(yǎng)基最多允許熔融一次，并且特指經(jīng)過高壓霉菌冷卻后的培養(yǎng)基還可以熔融一次后使用。且VRBA培養(yǎng)基冷卻后，再次熔融后非常容易噴涌，若溫度控制不當(dāng)，底部培養(yǎng)基熔融后很快就會(huì)發(fā)生噴涌，即培養(yǎng)基未完全熔融就會(huì)發(fā)生噴涌現(xiàn)象。
一般情況下不需要覆蓋。在實(shí)際操作過程中，若檢驗(yàn)員初次接觸該樣品類別，則因?yàn)椴淮_定是否會(huì)發(fā)生菌落蔓延，所以有必要在傾注培養(yǎng)基的時(shí)候再覆蓋一層，但如此反復(fù)多次測(cè)試后，若樣品中不存在菌落蔓延情況，則以后的檢驗(yàn)中都不需要進(jìn)行覆蓋。若重復(fù)多次測(cè)試后都有蔓延情況，則以后的檢驗(yàn)中都需要覆蓋，應(yīng)該在原培養(yǎng)基已凝固或半凝固時(shí)再傾注一層培養(yǎng)基。
建議新手們認(rèn)真按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行證實(shí)實(shí)驗(yàn)，此證實(shí)實(shí)驗(yàn)操作簡單，每一次VRBA上有菌落生長都進(jìn)行證實(shí)實(shí)驗(yàn)，如此往復(fù)3-4次，對(duì)于哪種形態(tài)才是大腸菌群均可了然于心。
選取15-150CFU之間的平板，挑選可疑菌落進(jìn)行證實(shí)實(shí)驗(yàn)。舉例如下：
若兩個(gè)連續(xù)梯度的4個(gè)平板上都要挑取菌落進(jìn)行證實(shí)實(shí)驗(yàn)，實(shí)際操作時(shí)，可靈活操作，如1:10的兩個(gè)平板上的菌落數(shù)分別為120、123，1:100的兩個(gè)平板的菌落數(shù)分別為16,18，嚴(yán)格來講必須至少在每個(gè)平板上分別挑取10個(gè)可疑菌落和10個(gè)典型菌落進(jìn)行證實(shí)實(shí)驗(yàn)，如此需要40根GBLB肉湯管。建議使用鎳合金接種環(huán)，以為VRBA上生長的菌落大部分在底層、且菌落一般比較大，被培養(yǎng)基覆蓋，傳統(tǒng)的接種環(huán)較細(xì)，用以刮去上層培養(yǎng)基比較方便，挑取菌落也比較方便。
如何進(jìn)行證實(shí)實(shí)驗(yàn)，菌落選取數(shù)量？
建議新手們VRBA上的所有不同形態(tài)的菌落都進(jìn)行證實(shí)實(shí)驗(yàn)。每種不同形態(tài)都挑取5-10個(gè)進(jìn)行證實(shí)實(shí)驗(yàn)（BGLB管足夠，建議多挑選幾個(gè)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)）。
注意：A. 每種可疑菌落挑取5個(gè)，每個(gè)菌落放入1根GBLB管中；B. “產(chǎn)氣者，記為大腸菌群陽性管‘’，就要求在實(shí)驗(yàn)前必須認(rèn)真篩選BGLB管，凡產(chǎn)氣的GBLB管應(yīng)棄去不用。
首先，在VRBA培養(yǎng)24h后進(jìn)行計(jì)數(shù)，分別計(jì)數(shù)可疑大腸菌群和典型大腸菌群的數(shù)量。假如在1:10的平板上的可疑大腸菌群有10個(gè)，典型大腸菌群有6個(gè)；然后進(jìn)行證實(shí)實(shí)驗(yàn)，假如10個(gè)可疑大腸菌群中有3個(gè)證實(shí)為陽性，6個(gè)典型大腸菌群中有5個(gè)證實(shí)為陽性，則計(jì)算方法如下：最終大腸菌群數(shù)=經(jīng)證實(shí)的大腸菌群數(shù)=可疑大腸菌群經(jīng)證實(shí)的數(shù)量+典型大腸菌群經(jīng)證實(shí)的數(shù)量=10×（3／10）×10+6×（5／6）×10＝80。
若平板上有很多菌落，最終證實(shí)全部為陰性，結(jié)果如何計(jì)算？
選取適宜菌落數(shù)的平板挑取菌落進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)，若證實(shí)全部為陰性，則需要再挑取更低稀釋度的平板上的菌落，建議可疑和典型菌落分別挑取10個(gè)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，若第二次證實(shí)實(shí)驗(yàn)均呈陰性，以＜1乘以最低稀釋度進(jìn)行計(jì)算。
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